Likva kromatografio estas la ĉefa metodo por testi la enhavon de ĉiu komponanto kaj malpuraĵoj en krudaj materialoj, intermedioj, preparoj kaj pakaj materialoj, sed multaj substancoj ne havas normajn metodojn por fidi, do estas neeviteble disvolvi novajn metodojn. En la disvolviĝo de likvaj fazaj metodoj, la kromatografia kolumno estas la kerno de likva kromatografio, do kiel elekti taŭgan kromatografian kolumnon estas kerna. En ĉi tiu artikolo, la aŭtoro klarigos kiel elekti likvan kromatografion el tri aspektoj: ĝeneralaj ideoj, konsideroj kaj aplika amplekso.
A.Superaj ideoj por elekti likvajn kromatografiokolumnojn
1. Taksi la fizikajn kaj kemiajn ecojn de la analito: kiel kemia strukturo, solvebleco, stabileco (kiel ĉu ĝi estas facile oksidebla/reduktita/hidrolizita), acideco kaj alkaleco, ktp., precipe la kemia strukturo estas la ŝlosilo. faktoro en determini la propraĵoj, kiel la konjugaciita grupo havas fortan transviola absorción kaj fortan fluoresko;
2. Determini la celon de analizo: ĉu alta disiĝo, alta kolumna efikeco, mallonga analiza tempo, alta sentemo, alta premo rezisto, longa kolumna vivo, malalta kosto, ktp.
- Elektu taŭgan kromatografian kolumnon: komprenu la konsiston, fizikajn kaj kemiajn ecojn de la kromatografia plenigaĵo, kiel la partiklograndeco, pora grandeco, temperaturtoleremo, pH-toleremo, adsorbado de la analito ktp.
- Konsideroj por elektado de likva kromatografiokolonoj
Ĉi tiu ĉapitro diskutos la faktorojn por esti konsiderataj kiam elektado de kromatografia kolumno de la perspektivo de la fizikaj kaj kemiaj trajtoj de la kromatografia kolumno mem. 2.1 Pleniga matrico
2.1.1 Silika ĝela matrico La pleniga matrico de la plej multaj likva kromatografiokolonoj estas silika ĝelo. Ĉi tiu speco de plenigaĵo havas altan purecon, malaltan koston, altan mekanikan forton, kaj estas facile modifi grupojn (kiel fenila ligo, amina ligo, cianoligado, ktp.), sed la pH-valoro kaj temperaturo-intervalo, kiujn ĝi toleras, estas limigitaj: la pH-intervalo de la plej multaj silikaĝelaj matrico-plenigaĵoj estas 2 ĝis 8, sed la pH-intervalo de speciale modifitaj silikaĝelaj ligitaj fazoj povas esti same larĝa kiel 1,5 ĝis 10, kaj ekzistas ankaŭ speciale modifitaj silikaĝelaj ligitaj fazoj, kiuj estas stabilaj ĉe malalta pH, kiel ekzemple Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, kiu estas stabila ĉe pH 1 ĝis 8; la supra temperaturlimo de la silika ĝela matrico estas kutime 60 ℃, kaj iuj kromatografiaj kolumnoj povas toleri temperaturon de 40 ℃ ĉe alta pH.
2.1.2 Polimermatrico Polimeraj plenigaĵoj estas plejparte polistiren-divinilbenzeno aŭ polimetacrilato. Iliaj avantaĝoj estas, ke ili povas toleri larĝan pH-gamon - ili povas esti uzataj en la intervalo de 1 ĝis 14, kaj ili estas pli rezistemaj al altaj temperaturoj (povas atingi super 80 °C). Kompare kun silic-bazitaj C18-plenigaĵoj, ĉi tiu speco de plenigaĵo havas pli fortan hidrofobecon, kaj la makropora polimero estas tre efika por apartigi specimenojn kiel proteinoj. Ĝiaj malavantaĝoj estas, ke la kolumna efikeco estas pli malalta kaj la mekanika forto estas pli malforta ol tiu de silic-bazitaj plenigaĵoj. 2.2 Partikloformo
La plej multaj modernaj HPLC-plenigaĵoj estas sferaj partikloj, sed foje ili estas neregulaj partikloj. Sferaj partikloj povas provizi pli malaltan kolumnan premon, pli altan kolumnan efikecon, stabilecon kaj pli longan vivon; kiam oni uzas alt-viskozecajn moveblajn fazojn (kiel fosfora acido) aŭ kiam la specimena solvo estas viskoza, neregulaj partikloj havas pli grandan specifan surfacareon, kiu pli favoras al la plena ago de la du fazoj, kaj la prezo estas relative malalta. 2.3 Partiklograndeco
Ju pli malgranda la partiklograndeco, des pli alta la kolumna efikeco kaj des pli alta la disiĝo, sed des pli malbona la altprema rezisto. La plej ofte uzata kolumno estas la 5 μm partiklograndeco; se la disiga postulo estas alta, oni povas elekti 1,5-3 μm-plenigaĵon, kio favoras solvi la disian problemon de iuj kompleksaj matricoj kaj multkomponentaj specimenoj. UPLC povas uzi 1.5 μm plenigaĵojn; 10 μm aŭ pli grandaj partiklograndecplenigaĵoj ofte estas uzitaj por duonpreparaj aŭ preparaj kolonoj. 2.4 Karbonenhavo
Karbonenhavo rilatas al la proporcio de ligita fazo sur la surfaco de silika ĝelo, kiu rilatas al specifa surfacareo kaj ligita fazokovrado. Alta karbonenhavo disponigas altan kolumnan kapaciton kaj altan rezolucion, kaj estas ofte uzata por kompleksaj specimenoj postulantaj altan apartigon, sed pro la longa interagado inter la du fazoj, la analiza tempo estas longa; kromatografiaj kolonoj kun malalta karbonenhavo havas pli mallongan analiztempon kaj povas montri malsamajn selektivecojn, kaj ofte estas uzitaj por simplaj provaĵoj kiuj postulas rapidan analizon kaj provaĵojn kiuj postulas altajn akvajn fazkondiĉojn. Ĝenerale, la karbonenhavo de C18 varias de 7% ĝis 19%. 2.5 Pora grandeco kaj specifa surfacareo
HPLC-adsorbadmedioj estas poraj partikloj, kaj la plej multaj interagoj okazas en la poroj. Tial, molekuloj devas eniri la porojn por esti adsorbitaj kaj apartigitaj.
Pora grandeco kaj specifa surfacareo estas du komplementaj konceptoj. Malgranda poro signifas grandan specifan surfacareon, kaj inverse. Granda specifa surfacareo povas pliigi la interagadon inter specimenaj molekuloj kaj kunligitaj fazoj, plibonigi retenon, pliigi specimenan ŝarĝon kaj kolumnan kapaciton, kaj apartigon de kompleksaj komponentoj. Plene poraj plenigaĵoj apartenas al ĉi tiu tipo de plenigaĵoj. Por tiuj kun altaj apartigpostuloj, oni rekomendas elekti plenigaĵojn kun granda specifa surfaco; malgranda specifa surfacareo povas redukti malantaŭan premon, plibonigi kolumnan efikecon kaj redukti ekvilibran tempon, kiu taŭgas por gradienta analizo. Kerno-ŝelaj plenigaĵoj apartenas al ĉi tiu speco de plenigaĵoj. Sur la kondiĉo de certigi apartigon, oni rekomendas elekti plenigaĵojn kun malgranda specifa surfacareo por tiuj kun altaj analizefikecpostuloj. 2.6 Pora volumo kaj mekanika forto
Porvolumeno, ankaŭ konata kiel "porvolumeno", rilatas al la grandeco de la malplena volumeno per unuopartiklo. Ĝi povas bone reflekti la mekanikan forton de la plenigaĵo. La mekanika forto de plenigaĵoj kun granda porvolumo estas iomete pli malforta ol tiu de plenigaĵoj kun malgranda porvolumo. Plenigaĵoj kun porvolumo malpli ol aŭ egala al 1.5 mL/g estas plejparte uzitaj por HPLC-apartigo, dum plenigaĵoj kun porvolumo pli granda ol 1.5 mL/g estas plejparte uzitaj por molekula ekskluda kromatografio kaj malaltprema kromatografio. 2.7 Kapa indico
Kapado povas redukti la vostopintojn kaŭzitajn de la interagado inter kunmetaĵoj kaj senŝirmaj silanolgrupoj (kiel jona ligo inter alkalaj kunmetaĵoj kaj silanol-grupoj, van der Waals-fortoj kaj hidrogenaj ligoj inter acidaj kunmetaĵoj kaj silanolgrupoj), tiel plibonigante kolonefikecon kaj pintformon. . Senkapaj ligitaj fazoj produktos malsamajn selektemojn relative al limigitaj ligitaj fazoj, precipe por polusaj provaĵoj.
- Apliko amplekso de malsamaj likva kromatografio kolumnoj
Ĉi tiu ĉapitro priskribos la aplikan amplekson de malsamaj specoj de likva kromatografio-kolumnoj tra kelkaj kazoj.
3.1 Inversa-faza C18 kromatografia kolono
La kolumno C18 estas la plej ofte uzata inversa-faza kolumno, kiu povas renkonti la enhavajn kaj malpurecajn testojn de plej multaj organikaj substancoj, kaj aplikeblas al mez-polusaj, malforte polusaj kaj ne-polusaj substancoj. La tipo kaj specifo de kromatografia kolumno C18 devas esti elektitaj laŭ la specifaj disigpostuloj. Ekzemple, por substancoj kun altaj apartigpostuloj, 5 μm * 4.6 mm * 250 mm specifoj estas ofte uzataj; por substancoj kun kompleksaj apartigmatricoj kaj simila poluseco, 4 μm * 4.6 mm * 250 mm specifoj aŭ pli malgrandaj partiklograndecoj povas esti uzataj. Ekzemple, la verkinto uzis 3 μm * 4.6 mm * 250 mm kolumnon por detekti du genotoksajn malpuraĵojn en celecoxib API. La disiĝo de la du substancoj povas atingi 2,9, kio estas bonega. Krome, sub la premiso certigi apartigon, se necesas rapida analizo, oni ofte elektas mallongan kolumnon de 10 mm aŭ 15 mm. Ekzemple, kiam la aŭtoro uzis LC-MS/MS por detekti genotoksan malpurecon en piperakina fosfato API, 3 μm * 2.1 mm * 100 mm kolumno estis uzita. La disiĝo inter la malpureco kaj la ĉefa komponanto estis 2.0, kaj la detekto de specimeno povas esti kompletigita en 5 minutoj. 3.2 Inversa-faza fenilkolono
Fenilkolono ankaŭ estas speco de invers-faza kolono. Ĉi tiu speco de kolono havas fortan selektivecon por aromaj komponaĵoj. Se la respondo de aromaj komponaĵoj mezuritaj per ordinara kolumno C18 estas malforta, vi povas konsideri anstataŭigi la fenil-kolumnon. Ekzemple, kiam mi faris celecoxib API, la ĉefa kompona respondo mezurita de la fenila kolumno de la sama fabrikanto kaj la sama specifo (ĉiuj 5 μm * 4.6 mm * 250 mm) estis proksimume 7 fojojn tiu de la C18-kolumno. 3.3 Normal-faza kolumno
Kiel efika suplemento al inversa-faza kolumno, normal-faza kolumno taŭgas por tre polusaj kunmetaĵoj. Se la pinto estas ankoraŭ tre rapida dum eluiĝo kun pli ol 90% akva fazo en la inversa-faza kolumno, kaj eĉ proksime al kaj interkovras kun la solventa pinto, vi povas konsideri anstataŭigi la normal-fazan kolumnon. Ĉi tiu speco de kolumno inkluzivas hilan kolumnon, amino-kolumnon, cian-kolumnon ktp.
3.3.1 Hila kolumno Hila kolumno kutime enigas hidrofilajn grupojn en la ligita alkilĉeno por plifortigi la respondon al polusaj substancoj. Ĉi tiu tipo de kolumno taŭgas por analizo de sukeraj substancoj. La aŭtoro uzis ĉi tiun tipon de kolumno kiam faris la enhavon kaj rilatajn substancojn de xilozo kaj ĝiaj derivaĵoj. La izomeroj de xilosa derivaĵo ankaŭ povas esti bone apartigitaj;
3.3.2 Amina kolumno kaj ciano-kolumno Amino-kolumno kaj ciano-kolumno rilatas al la enkonduko de amino- kaj ciano-modifoj ĉe la fino de la ligita alkilĉeno, respektive, por plibonigi la selektivecon por specialaj substancoj: ekzemple, amina kolumno estas bona elekto. por la apartigo de sukeroj, aminoacidoj, bazoj kaj amidoj; cianokolono havas pli bonan selektivecon kiam apartigas hidrogenitajn kaj nehidrogenitajn strukturajn similajn substancojn pro la ĉeesto de konjugaciitaj ligoj. Amina kolumno kaj cianokolono ofte povas esti ŝanĝitaj inter normalfaza kolumno kaj inversa faza kolumno, sed ofta ŝanĝado ne rekomendas. 3.4 Kirala kolono
Kirala kolono, kiel la nomo sugestas, taŭgas por la apartigo kaj analizo de kiralaj kunmetaĵoj, precipe en la kampo de farmaciaĵoj. Tiu speco de kolono povas esti pripensita kiam konvenciaj inversfazaj kaj normalfazaj kolonoj ne povas atingi la apartigon de izomeroj. Ekzemple, la aŭtoro uzis 5 μm * 4.6 mm * 250 mm kiralan kolonon por apartigi la du izomerojn de 1,2-difeniletilendiamino: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiamino kaj (1R, 2R)-1, 2 -difeniletilendiamino, kaj la disiĝo inter ambaŭ atingis ĉirkaŭ 2,0. Tamen, kiralaj kolonoj estas pli multekostaj ol aliaj specoj de kolonoj, kutime 1W+/peco. Se necesas tiaj kolumnoj, la unuo devas fari sufiĉan buĝeton. 3.5 Ion-interŝanĝa kolumno
Joninterŝanĝkolumnoj taŭgas por la apartigo kaj analizo de ŝarĝitaj jonoj, kiel ekzemple jonoj, proteinoj, nukleaj acidoj, kaj kelkaj sukersubstancoj. Laŭ la plenigaĵo, ili estas dividitaj en katjoninterŝanĝajn kolumnojn, anjoninterŝanĝajn kolumnojn kaj fortajn katjoninterŝanĝajn kolumnojn.
Kationinterŝanĝkolumnoj inkludas kalci-bazitajn kaj hidrogen-bazitajn kolonojn, kiuj estas plejparte taŭgaj por la analizo de katjonaj substancoj kiel ekzemple aminoacidoj. Ekzemple, la aŭtoro uzis kalci-bazitajn kolumnojn kiam oni analizis kalcian glukonaton kaj kalcian acetaton en flua solvo. Ambaŭ substancoj havis fortajn respondojn ĉe λ=210nm, kaj la disiĝo-grado atingis 3.0; la aŭtoro uzis hidrogen-bazitajn kolumnojn kiam oni analizis glukoz-rilatajn substancojn. Pluraj gravaj rilataj substancoj - maltozo, maltotriozo kaj fruktozo - havis altan sentemon sub diferencigaj detektiloj, kun detektlimo tiel malalta kiel 0.5 ppm kaj apartiggrado de 2.0-2.5.
Anjonaj interŝanĝkolumnoj estas ĉefe taŭgaj por la analizo de anjonaj substancoj kiel organikaj acidoj kaj halogenaj jonoj; fortaj katjoninterŝanĝaj kolumnoj havas pli altan ion-interŝanĝan kapaciton kaj selektivecon, kaj taŭgas por la apartigo kaj analizo de kompleksaj specimenoj.
Ĉi-supra estas nur enkonduko al la tipoj kaj aplikaj gamoj de pluraj komunaj likva kromatografio-kolumnoj kombinitaj kun la propra sperto de la aŭtoro. Ekzistas aliaj specialaj specoj de kromatografiaj kolumnoj en faktaj aplikoj, kiel grandporaj kromatografiaj kolumnoj, malgrand-poraj kromatografiaj kolumnoj, afinec-kromatografio-kolumnoj, plurreĝimaj kromatografiaj kolumnoj, ultra-altaj rendimentaj likva kromatografio-kolumnoj (UHPLC), superkritikaj fluid-kromatografiaj kolumnoj ( SFC), ktp. Ili ludas gravan rolon en malsamaj kampoj. La specifa tipo de kromatografia kolumno devas esti elektita laŭ la strukturo kaj propraĵoj de la specimeno, apartigpostuloj kaj aliaj celoj.
Afiŝtempo: Jun-14-2024